遇到ELISA實驗失敗別灰心，重新開始的關鍵是?系統性排查、優化操作、強化質控?。

一、實驗前準備與評估

1、回顧與記錄?：復盤失敗原因（如高背景、信號弱），記錄試劑批號、樣本信息。

2、試劑與材料檢查?：

確認試劑在有效期內，按說明書要求保存（避光、低溫）。

嚴禁混用不同批號或廠家的試劑?。

檢查耗材（吸頭、酶標板）無破損，使用低吸附耗材。

3、樣本預處理?：

離心?：血清/血漿樣本4℃、2000-3000g離心10-15分鐘，去除碎片。

分裝?：按一次用量分裝，避免反復凍融。

稀釋?：通過預實驗確定稀釋比例（如5-10倍梯度稀釋），使樣本OD值落在標準曲線線性范圍內。

二、優化實驗操作流程

1、標準曲線制備?：

復溶?：用試劑盒提供的稀釋液重溶凍干標準品，短暫離心后混勻。

梯度稀釋?：采用反向稀釋法或倍比稀釋法，配制濃度梯度，覆蓋樣本預期濃度范圍。

加樣?：標準品和樣品需在同一塊酶標板上同步檢測，使用校準移液器，垂直加樣至孔底，避免觸碰孔壁或產生氣泡。

2、加樣與孵育?：

加樣?：建議從低濃度（標準品）到高濃度（樣本）加樣，減少“跳孔”誤差。

孵育?：嚴格控制溫度（通常37℃）和時間，使用恒溫設備避免波動，覆蓋封板膜防止蒸發。

3、洗滌步驟?：

洗滌液?：使用含0.05%-0.1% Tween 20的PBS緩沖液。

操作?：每孔加滿洗液，浸泡30秒至1分鐘后吸棄，重復洗滌3-5次，避免過度洗滌。

4、顯色與終止?：

顯色?：避光顯色，根據陽性孔與陰性孔顏色對比度判斷終止時機（如TMB顯色15-30分鐘）。

終止?：加入終止液（如TMB用硫酸），立即讀數。

三、數據讀取與分析

1、儀器設置?：

酶標儀預熱?：開機預熱15分鐘。

波長選擇?：設置主波長（如TMB為450nm）和參考波長（如630nm）。

調零?：使用空白孔（僅含緩沖液）調零。

2、數據計算?：

扣除背景?：樣本OD值減去空白孔平均OD值。

標準曲線擬合?：使用四參數邏輯回歸（4-PL）等軟件擬合標準曲線，要求R2≥0.99。

計算濃度?：將樣本OD值代入標準曲線方程，計算濃度并乘以稀釋倍數。

四、質量控制與驗證

1、對照設置?：

空白孔?：僅含顯色液，OD值應（通常<0.1）。

陰性對照?：OD值應顯著低于陽性對照（P/N比值≥2）。

陽性對照?：OD值應明顯高于Cut-off值，證明試劑活性正常。

2、重復性驗證?：

復孔檢測?：每個樣本設置2-3個復孔，計算平均OD值，單個OD值與均值偏差應≤20%。

批內/批間精密度?：計算變異系數（CV值），應≤15%。

3、回收率實驗?：在樣本中添加已知濃度標準品，回收率應在80%-120%范圍內，驗證方法準確性。

五、常見問題預防與快速應對

高背景?：優化封閉條件（如增加BSA濃度至1%）、增加洗滌次數（5-8次）、更換封閉劑。

信號弱?：優化抗體濃度（進行棋盤滴定）、延長孵育時間、確保底物新鮮且避光使用。

重復性差?：使用校準移液器和多通道加樣器、確保恒溫孵育、檢查洗板機管路是否通暢。

邊緣效應?：使用封板膜密封反應板，避免將多塊板疊加放置在孵育箱中，確保孵育箱溫度穩定且分布均勻。

六、尋求技術支持

若按上述流程操作后問題仍存在，聯系試劑盒技術支持，提供：

完整實驗數據（標準曲線圖、所有OD值）。

試劑盒批號和有效期。

問題詳細描述（如異常現象、已嘗試操作）。

關鍵預防措施?：

1、試劑管理?：嚴格按說明書保存（避光、低溫），避免混用不同批號試劑；開封后分裝使用。

2、操作規范?：使用帶濾芯吸頭防止交叉污染；加樣垂直、緩慢；洗板后拍干。

3、環境控制?：保持實驗室溫濕度穩定（建議25℃，濕度<60%），避免震動或強光直射。

4、定期維護?：每月校準移液器、酶標儀；清洗洗板機管路，確保無堵塞。

建立并嚴格執行標準化操作流程（SOP），是獲得可靠、可重復結果的根本保障。